鈣離子對於細胞免疫反應、細胞增生等各種功能運作扮演關鍵性角色，鈣離子濃度的變化甚至會直接影響細胞凋亡、決定細胞的生與死。過去學界利用X光晶體繞射發現，YetJ是一種鈣離子通道膜蛋白，但對於鈣離子傳輸過程細節並不清楚。國立清華大學化學系江昀緯教授實驗室利用雙電子自旋共振DEER (Double Electron-Electron Resonance) 技術，捕捉了YetJ鈣離子通道的動態構形、解析其結構、改寫了通道運作原理，為細胞傳輸鈣離子研究再推進一大步。

這篇由江昀緯與其指導的三位博士生李介勤、高得瑜、鄭竹鈞完成的論文「細胞鈣離子通道的結構與調控機制」，揭開了YetJ膜蛋白傳輸鈣離子的運作原理。過去學界認為YetJ鈣離子通道的開闔僅受周圍pH調控，但清大這項研究揭露新的開闔位置、新結構、發現雙重調控機制，證實要傳輸鈣離子不只pH值要對、還必須有適當膜電位差配合。

此篇論文最近登上頂尖學術期刊《美國國家科學院》PNAS，所有研究工作都是在清大江昀緯教授實驗室完成，揭開鈣離子傳輸蛋白的神秘面紗。

細胞膜蛋白：藥物 病毒 離子進出細胞的門戶

細胞膜蛋白相關基因數佔了人類基因定序1/3以上，重要性不言可喻。膜蛋白更是藥物是否能進入細胞的最關鍵因素，很多藥物的設計都是針對膜蛋白。例如各國積極研發中對付COVID-19的抗體、藥物，研究目標便專注於如何用藥物阻斷病毒與人體細胞膜蛋白的結合。然而，膜蛋白周圍有很強的疏水性、四圍包覆很多脂質(lipids)，這樣的環境對於純化、實驗工作是極困難的挑戰。要如何將膜蛋白從天然脂質環境中分離而不影響結構？如何在接近細胞膜的脂質環境鑑定膜蛋白結構？如何捕捉其動態構形等，這些都是當今結構生物學的重要課題。

雙電子共振技術 捕捉鈣離子通道多重構形

「我們將YetJ置入類細胞膜環境的lipid nanodisc脂質奈米盤中，發現鈣離子通道結構與前人發表的晶體結構大大不同，嚇了一跳、覺得難以置信。」江昀緯說，細胞膜的脂質環境複雜，所以要鑑定結構時，大部分科學家會選擇將膜蛋白抽離細胞膜，置放在界面活性劑(Detergent)中以方便獲得晶體、或方便電子顯微鏡研究。不同於其他研究所獲得的靜態結構，江教授實驗室選擇的是將鈣離子通道置入類細胞膜脂質環境中，量測電子標記間的距離，獲得的是動態結構、捕捉到鈣離子通道的多重構形，揭露生物分子的複雜性。

江昀緯團隊採用全台僅有、科技部與清大共同補助四千多萬的電子自旋共振(Electron Spin Resonance)實驗設備，進行雙電子間的長距離(0.5–8 nm)量測，不只觀察到鈣離子通道的開闔、更捕捉到膜蛋白以多重構形狀態存在。

江昀緯團隊發現，YetJ鈣離子通道至少同時存在四種不同構形，藉由這四種構形比例的轉換，鈣離子才得以傳遞、進出細胞膜。而這四種構形的比例平衡會受到環境pH值調控，但驅動鈣離子一步一步穿越通道的動力卻是由內外膜的鈣離子濃度差所提供。「鈣離子的調控是受到多重構形組合、環境pH值、內外膜電位差等等因素精密的調控，並非像之前所認知的僅僅由一開一闔兩個單純的結構所決定。這研究再次揭露生物分子運作的複雜性，驗證這個鈣離子通道原來是傳輸蛋白。」江昀緯說。

揭露動態構形 新通道 雙重鈣離子調控機制

江昀緯解釋，之前的晶體結構提供了一開一闔的通道運作模型，但令人不解的是：根據已知模型，pH環境一稍微偏酸性，通道就全開、鈣離子便不停地傳輸！真的是這樣嗎？細胞內pH經常性在變化，細胞機能不就很容易大起大落？如今，我們的研究捕捉到同時存在的四種結構、以及他們之間的轉換協調、揭露雙重調控機制。在偏酸性環境，通道口傾向關閉；在稍微偏鹼性環境下，通道口一端會大幅度打開與鈣離子結合、但鈣離子無法通過細胞膜。只有當濃度梯度足夠時，另一側開口才會打開，將鈣離子傳遞過去。清華團隊的研究首次揭露，這是一個受pH調控的電壓閘門控制型傳輸蛋白。

這篇研究也解析了一個新的鈣離子通道入口，與之前的晶體結構推測的入口不一樣。江昀緯表示，由於這個膜蛋白對於周圍脂質組份非常敏感，所以我們在脂質環境中解出來的構形與X-ray晶體有很多相異處，連鈣離子的通道入口都不一樣。研究過程中，有一段時間我們的擔憂遠超過喜悅，總覺得是不是我們哪裡做錯了？怎麼差這麼多？經過一再實驗驗證、還花了很多時間進行分子動力學模擬、理論計算結合實驗結果，才得以確認在脂質上的構形確實與晶體很不一樣，鈣離子傳輸機制也不一樣，改寫了之前建立的分子模型。

「相信自己做得到」很重要

此篇論文的第一作者為李介勤博士，2020年從清大畢業，目前服替代役中，積極準備赴國外進行博士後研究工作。江昀緯十分肯定介勤對科學的熱情與堅持，「介勤是清大大學部直升博班的高材生，不僅聰明、有熱情、有毅力、還非常努力。這個研究在剛開始的前三年舉步維艱，純化出的蛋白質沒有活性、對鈣離子沒有反應、沒有進展、耗費了我們很多資源。我曾經幾度想要幫他換簡單一點的題目，但介勤很堅持try下去，相信自己做得到！」江昀緯強調，他常鼓勵研究生用正面態度面對失敗：「沒有失敗代表你不夠創新！實驗結果不如預期其實是好事，它在跟你說你還不夠了解它。趕快再設計下個實驗，不要浪費時間傷心。……要正面迎敵、才能克服它、持續超越、往前！」

江昀緯的下一個研究目標是在分子層次研究為何這個膜蛋白對鈣離子具有特殊選擇性，「YetJ是細菌的膜蛋白，實驗室同時還研究人類細胞內質網的YetJ同源膜蛋白！將會揭露更驚奇的自然界祕密、會有說不完的故事！」

台灣在鈣離子膜蛋白研究建立了重要里程碑

YetJ是一個跨物種的膜蛋白，幾乎所有物種都有它的存在，但科學界對它的了解相當有限。例如，植物上也有YetJ的同源蛋白家族，當這類YetJ膜蛋白過量表現時，被發現能幫助農作物抵抗過冷、過熱的生存環境、有效提高農作物存活率。這樣的能力在未來地球暖化加劇、極端氣候發生頻率變高的情況下將特別有價值。另外，在人類細胞中，這類蛋白直接影響細胞凋亡機制、掌控正常細胞、癌細胞的生與死。本論文研究結果建立這類YetJ鈣離子傳輸家族在藥物設計、醫學研究、農作物的改良等方面的新方向，備受國際學界肯定，使台灣在膜蛋白鈣離子傳輸的研究領域建立一個重要的里程碑。

論文連結： https://doi.org/10.1073/pnas.2014094117